SA-β-gal的檢測方法,你了解多少?
更新時(shí)間:2021-09-16 點(diǎn)擊次數(shù):10549次
生衰退的變化過程。細(xì)胞衰老時(shí),衰老相關(guān)半乳糖苷酶(
SA-β-gal)的活性會顯著增加,故常常檢測衰老相關(guān)半乳糖苷酶的活性以區(qū)分正常細(xì)胞與衰老細(xì)胞。目前,不同條件或化合物作用細(xì)胞后,常常用衰老相關(guān)半乳糖苷酶檢測作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志之一。
SA-β-gal檢測方法主要分為細(xì)胞化學(xué)染色法和熒光法。
一、細(xì)胞化學(xué)染色法:SA-βgal在pH6.0時(shí),可將5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷水解,產(chǎn)生不溶于水的藍(lán)色物質(zhì)。這種藍(lán)色產(chǎn)物相當(dāng)穩(wěn)定,固定干燥后避光可保存幾個月。通過計(jì)算總?cè)后w中藍(lán)色細(xì)胞的數(shù)量,可以很容易地確定SA-β-半乳糖苷酶陽性的細(xì)胞比例,即衰老細(xì)胞的比例。但是需要注意的是,在所有細(xì)胞中普遍存在酸性半乳糖苷酶,在pH4.0時(shí)發(fā)揮作用。其實(shí)SA-βgal發(fā)揮作用的最適pH為4.5,但是在pH4.5時(shí),酸性半乳糖苷酶也會水解底物,因此需要使用SA-βgal次適pH6.0,才能確保藍(lán)色產(chǎn)物是由于SA-βgal的作用而產(chǎn)生的。通常我們使用pH為6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。
二、熒光法:熒光法需要借助另一種底物——C12FDG,不具有熒光,能透過細(xì)胞膜,但被βgal水解后可產(chǎn)生綠色熒光產(chǎn)物。利用流式細(xì)胞儀可檢測綠色熒光的產(chǎn)生,藉此反映βgal的表達(dá)。因此要想檢測SA-βgal的活性,需要先將溶酶體堿化至pH6.0。這一過程可使用氯喹或巴弗洛霉素A1等,可降低溶酶體的酸度,使溶酶體堿化至pH6.0。然后向細(xì)胞中加入C12FDG,孵育后制成可供流式分析細(xì)胞懸液,即可利用FC500MPL流式細(xì)胞儀等檢測SA-βgal的表達(dá)。
SA-β-gal細(xì)胞化學(xué)染色法通常需要半小時(shí)染色,數(shù)小時(shí)甚至一天時(shí)間等待染色完成以觀察和計(jì)數(shù),而熒光法需要4至8小時(shí)處理細(xì)胞,1天內(nèi)可完成計(jì)數(shù)。前者不僅可用于細(xì)胞培養(yǎng)液還可用以組織切片的染色,而且所需試劑和設(shè)備簡單,而后者更為高效,靈敏,定量更為準(zhǔn)確。因此,根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同目的可選擇不同的檢測方法。